Ziel der Entwicklung

Kollagenbasierte Biomaterialien werden in der regenerativen Medizin zur Heilung von Gewebedefekten, z. B. zur Behandlung von Wunden, Stillung von Blutungen oder Rekonstruktion von Knochen und Knorpelschäden, verwendet. Der Fokus der Forschung hat sich jedoch innerhalb der letzten Jahre weg vom Einsatz reinen Kollagens zur Applikation der extrazellulären Matrix (EZM) verschoben. Diese ist der Teil des Gewebes von Tieren, der zwischen den Zellen liegt und diese geflechtartig umgibt. Die EZM besteht aus einem komplexen Gerüst an kollagenen und elastischen Fasern, das in die sogenannte Grundsubstanz eingebettet ist. Diese Grundsubstanz setzt sich aus verschiedenen Proteoglykanen und Glykoproteinen zusammen.
Der Einsatz von EZM-Materialien in der Biomedizin erfordert die Entfernung zellulärer Bestandteile über einen oder mehrere Dezellularisierungsschritte. Die wesentlichen Bestandteile der EZM sowie deren mechanische und biochemische Eigenschaften sollten dabei jedoch so gut wie möglich erhalten bleiben.
Während die methodischen Grundlagen für die Analytik von Kollagen und daraus hergestellten Produkten im ASTM-Standard F2212-11 (Standard Guide for Characterization of Type I Collagen as Starting Material for Surgical Implants and Substrates for Tissue Engineered Medical Products) festgehalten sind, existiert für die Routineprüfung und Qualitätsbeurteilung biologischer Scaffoldmaterialien aus dezellularisierter EZM keine allgemein anerkannte Methode. Ziel des Projekts war daher die Entwicklung massenspektrometrischer Analyseverfahren zur Bestimmung der wesentlichen Inhaltsstoffe von medizinischen Gerüstmaterialien aus EZM. Die Verfahren sollten als Routineprüfungen etablierbar sein und für die Charakterisierung von EZM-basierten Produkten, die aus unterschiedlichen Geweben unter Variation der Herstellungsbedingungen gewonnen wurden, herangezogen werden.

Vorteile und Lösungen

Das Ziel des Projekts, die Entwicklung von massenspektrometriebasierten Assays, die die quantitative Analyse wichtiger EZM-Bestandteile ermöglichen, wurde erreicht. Für die beiden Glykoproteine Fibronektin und Laminin wurde jeweils ein MRM-Assay erstellt, mit dem eine absolute Quantifizierung erfolgen kann. Diese Assays sind auf EZM-Proben boviner, porciner und equiner (nur Laminin) Herkunft anwendbar.
Zunächst wurden hierfür die Gewebe Haut, Perikard, Sehne und Dünndarm der Spezies Bos taurus, Equus caballus und Sus scrofa durch pH-, Tensid- und Enzymbehandlung, einzeln oder in Kombination, dezellularisiert. Ein Kennwert für die erfolgreiche Dezellularisierung tierischer Gewebe ist eine DNA-Konzentration unter 50 ng/mg TS. Dies konnte für die bovine Sehne und die vor der Behandlung gespaltenen Häute erreicht werden. Aus diesen pH-behandelten Spalten wurden außerdem zunächst Dispersionen und anschließend durch Gefriertrocknung Vliese hergestellt.
Zur Identifizierung der verschiedenen EZM-Komponenten in den unbehandelten und behandelten Proben wurde eine qualitative massenspektrometrische Analyse durchgeführt. Hier konnten sowohl verschiedene Kollagentypen als auch diverse Proteoglykane und Glykoproteine identifiziert werden.
Der Schwerpunkt des Projektes war die Erstellung von MRM-Assays für die quantitative Analyse der Glykoproteine Fibronektin und Laminin. Hierfür war die Identifizierung geeigneter Peptide nötig. Diese sollten reproduzierbar messbar, spezifisch für das jeweilige Protein und nicht modifiziert sein. Zur Identifizierung dieser Peptide wurden Standardproteine boviner Herkunft beschafft und mittels LC-MS/MS analysiert. Anhand dieser Messungen wurden je drei Peptide identifiziert, die den genannten Kriterien entsprachen. Für jedes Peptid wurden die Geräteparameter optimiert. Je eines der Peptide wurde zur Synthese durch einen externen Anbieter ausgewählt. Diese synthetisierten Peptide dienten der Kalibration der Methode. Die so entwickelten Assays wurden genutzt, um die Fibronektin- und Laminingehalte der hergestellten Gewebeproben zu bestimmen.
Zusätzlich wurden die Gewebeproben prozessbegleitend mit der Dezellularisierung auf andere EZM-Komponenten untersucht. Die Gehalte an Kollagen, Elastin sowie der sulfatierten Glykosaminoglykane als auch der nicht sulfatierten Hyaluronsäure wurden bestimmt.
Die neu entwickelten Methoden wurden abschließend an kommerziell erhältlichen Medizinprodukten auf Basis aller drei getesteten Spezies und den aus Hautspalten hergestellten Vliesen angewendet. Es zeigte sich, dass die MRM-Methoden prinzipiell für den Nachweis von Fibronektin und Laminin in EZM-basierten Produkten geeignet sind. Laminin wurde in allen getesteten Proben nachgewiesen, Fibronektin nur im porcinen Medizinprodukt.

Zielgruppe und Zielmarkt

Durch die Projektergebnisse können den Herstellern von Medizinprodukten neue Analysemethoden zur Quantifizierung von EZM-Bestandteilen angeboten werden. Zusätzlich konnten Informationen zur Wirksamkeit verschiedener Dezellularisierungsstrategien generiert werden, anhand derer die Anwender entscheiden können, wie sie zukünftig bei der Prozessierung ihrer Materialien vorgehen wollen.
Im Rahmen der Qualitätskontrolle sowie der Optimierung von EZM-basierten Produkten sind zuverlässige Methoden für die qualitative und quantitative Analytik von kritischen Komponenten von enormer Bedeutung. Hinzu kommt, dass mit der neuen europäischen Verordnung über Medizinprodukte, die im Mai 2017 in Kraft getreten ist, deutlich verschärfte Regelungen hinsichtlich der Produktcharakterisierung eingeführt wurden. Hersteller von Medizinprodukten müssen demnach im Rahmen der Zulassung Aussagen zum Vorhandensein, dem Gehalt sowie der Herkunft der Produktinhaltsstoffe machen. An der Etablierung einer schnellen Routineprüfung für die Identifizierung und Quantifizierung von EZM-Komponenten besteht daher seitens der Industrie großes Interesse.
In den letzten Jahren hat sich eine Reihe von Firmen etabliert, die hochwertige Materialien aus dezellularisierter EZM herstellen. Dabei handelt es sich vor allem um kleine und mittelständische Unternehmen aus den Bereichen Medizintechnik, Pharmazie und regenerative Medizin. Diesen Firmen können die entwickelten MS-Analyseverfahren als Dienstleistung angeboten werden.